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流行性乙型脑炎临床诊断和实验室检验方法
发布日期: 2007-01-23 浏览次数: 撰稿人: 部所: 字体:

         

 流行性乙型脑炎(简称乙脑或乙型脑炎)是一种自然疫源性疾病,是由携带乙脑病毒的蚊子叮咬人类引起的急性中枢神经系统传染病,临床以高热、惊厥、昏迷、抽搐为主要表现,严重者可致死亡,部分病例可留有后遗症。

 乙脑主要发生在东亚、远东及太平洋西岸地区,近年来在太平洋西区的一些岛屿及澳大利亚北部的约克角也发现有乙脑病例。我国为乙脑的高发区,上世纪60-70年代曾发生全国性大流行。80年代以后,随着对适龄儿童进行乙脑疫苗尤其是减毒活疫苗的接种,我国乙脑发病率有了较大幅度的下降,并长期维持在相对较低水平。但每年的病例数仍波动于1-2万人,而且局部地区时有爆发流行,如1999年夏季广西自治区发生乙脑爆发,波及12个区县,发病人数逾百人,病死率高达22%; 2000年四川、贵州、重庆和河南乙脑报告病例数明显上升;2003年广西的桂平县发生乙脑的爆发流行。我国除新疆、西藏外,其他各省、区均有乙型脑炎流行[2]居全国发病前5位的省份为:贵州、陕西、重庆、四川和山西。近几年来广东省每年都有散发乙型脑炎病例,间或有乙型脑炎疫情暴发。

 乙脑无特效治疗方法又好发于儿童,治疗费用昂贵,其家庭很可能因此而陷于贫困,甚至放弃治疗。一旦有后遗症,更将影响一个人的一生的生活质量,整个家庭、社会要背上沉重的经济和精神双重负担。但乙脑同时又是可以预防的疾病,人们可以采用包括接种疫苗在内的多种措施有效预防乙脑的发生。

 

             乙脑病例定义

1.流行病学:

  在乙脑流行地区居住,在蚊虫叮咬季节发病或发病前15天内在蚊虫叮咬季节到过乙脑流行地区旅行。

2.症状体征

    (1)急性起病,发热头痛,喷射性呕吐,嗜睡,可伴有脑膜刺激症状。  

    (2)急性起病,发热2-3d后出现不同程度的意识障碍,如昏迷、抽搐、肢体痉挛性麻痹等中枢神经症状,或发展至中枢呼吸循环衰竭。

3.脑脊液检查:

    脑脊液:压力增高,呈非化脓性炎症改变[外观清亮,蛋白轻度增高,糖与氯化物正常,白细胞增高,多在(50~500)×106/L,早期多核细胞为主,后期单核细胞为主]。

4.病原学及血清学检查结果

    (1)血清中抗乙脑IgM抗体阳性(在乙脑非流行区),在同一份或随后的血清标本中经其它实验证实IgG抗体阳性(在乙脑流行区)。

    (2)脑脊液抗乙脑IgM抗体阳性。

    (3)在组织、血液或其它体液中通过直接免疫荧光或PCR法检测到乙脑病毒抗原或基因。

    (4)恢复期血清中抗乙脑 IgM/IgG抗体或中和抗体或血凝抑制抗体等滴度比急性期有4倍以上升高者,1个月内没有接种乙脑疫苗,并排除其它虫媒病毒感染。

    (5)脑脊液、脑组织、血清分离乙脑病毒阳性。

5.病例分类

            (1)疑似病例:

    流行病学史加上症状体征中的任意一条即为乙脑疑似病例

    (2)乙脑临床诊断病例:

 符合脑脊液检查结果的乙脑疑似病例为临床诊断病例。

        (3)乙脑确诊病例:

    符合病原及血清学检测结果之一的乙脑疑似病例为确诊病例。

 

              乙脑标本采集技术

 

1.标本采集类型:

  病毒分离成功的关键取决于采集标本的质量,及其保存运输等环节。应尽早采集分离病原所用标本。收集病毒血症期的血液或发病早期的脑脊液进行病毒分离,但阳性率不高。如取脑组织活检材料或尸检材料,病毒分离的成功率较高,但前者不易为病人所接受,后期只能用于死后诊断。其他组织如肝、脾、肾、淋巴结等很少被收集用于分离病毒。

    (1)脑脊液:按医疗操作规程由医护人员采集。

    (2)尸检标本:取死者脑组织2厘米×2厘米大小,置于螺口试管中。

2.标本采集人员及保护:

    乙脑血液及脑脊液标本均应由医院有经验的护士采集,应结合其它检验采集,避免多次不必要采集以免给病人带来必要要麻烦。

3.标本采集时间:

    须采集病例的急性期和恢复期血清,尽早采集急性期血样,最迟不晚于发病后7天。恢复期血样则在发病后3-4周采集。

4.标本采集数量及间隔时间:

    无菌采集2ml血液标本,分离血清,冷冻。详细登记有关病例的姓名、性别、年龄等基本信息,发病日期、采样日期等。

5.标本运送:密封及包装、运输方式、交接记录、标签

    (1)血清标本应带冰在24小时内运送至实验室。应分装多管冷冻保存,0.5毫升/管。

    (2)标本至实验室后,病毒分离标本应尽快进行接种分离,48h内能进行接种的可置于4℃保存,如未能接种应置-70℃或以下保存。

    (3)血清标本可在4℃存放一周,长期保存置-20℃或以下。

6.标本储存

  标本采集后应立即冷冻保存,如未能及时接种应置-70℃或以下保存。若需运送至上级单位,则应由专业人员运用冷藏装置运送标本。

 

                    乙脑实验室检验方法及注意事项

 1.病毒学诊断:

从病人的脑组织,脑脊液或血液中查到流行性乙型脑炎病毒或抗原或特异性的核酸,即可作出病原学诊断。乙脑病毒分离主要采用细胞培养(白蚊伊蚊细胞、BHK细胞及C6/36细胞等)和小白鼠接种法。

    (1) 病毒分离

    标本的处理:血液标本可无菌法用玻璃珠去纤维蛋白或如肝素等防凝后,直接接种于敏感动物或鸡胚,或进行细胞培养,脑脊液可以直接接种。脑组织可加无菌10%脱脂奶或生理盐水,研磨成匀浆,经1500r/min30min离心沉淀,取上清液接种动物或细胞。为防止细菌污染,可于研磨匀浆过程中加入1000U/mL的青霉素和1000ug/mL的链霉素。

    (2)常用的敏感动物和鸡胚

    分离流行性乙型脑炎常用的敏感动物为三周龄的小白鼠或乳鼠(1-3日龄),每鼠脑内接种标0.03mL/三周鼠(0.01Ml/乳鼠),3d-21d期间出现毛耸、弓背、肢体麻痹等发病者为可能阳性,再进一步鉴定分离的病毒。如接种标本的小鼠21d内不发病则宜将小鼠脑组织研磨成10%悬液,1500r/min 离心30min后取上清液再作宣传接种,接种新的小鼠或细胞的培?ご跣哉咦魑掷氩《疽跣浴<ε叨砸倚湍匝撞《久舾校瓯咀⑸溆?7-9日龄鸡胚的脑或(和)绒毛尿囊膜,放37℃孵育,2d-5d后如鸡胚发生死亡,取鸡胚或绒毛尿囊膜即可用于作乙脑病毒的鉴定(鸡胚分离病毒目前已经较少使用)。

    (3)常用的敏感细胞

    流行性乙型脑炎病毒对许多种体外培养的细胞敏感,可用于分离病毒,常用的有鸡胚纤维母细胞、人胚肾细胞、人胚肺细胞、猪肾、地鼠肾、猴肾细胞,受感染的细胞能出现明显的细胞病变。蚊传代细胞C5/36株乳地鼠肾BHK21株或猴肾Vero传代株细胞对乙型脑炎病毒敏感。

    (4)病毒鉴定

    用中和试验进行鉴定,如病毒的感染力能被抗乙型脑炎病毒免疫血清中和,则可定为乙型?匝撞《尽?

2.血清学检验方法:

    可供采用的有酶联免疫吸附试验、血凝试验、中和试验、反向血凝抑制试验、间接免疫荧光试验等,应根据检验目的选择相应的实验方法,要尽量做到方法统一。

    (1)中和试验

    中和抗体与病毒结合,能改变病毒表面的构形,使病毒不能与敏感细胞表面的受体相结合,不能使敏感细胞发生病毒感染而产生细胞病变。中和试验以测定病毒的感染力为基础,必须在敏感的动物或细胞中进行,病毒与中和抗体之间,具有质和量的相关性。乙型脑炎病毒只能被抗乙脑中和抗体所中和,抗体量的多少决定病毒被中和的完全程度。因此,中和试验可用于鉴定病毒,亦可用于测定抗体,中和抗体滴度的高低与机体抗病毒的保护力呈正相关。一般有两种方法,一为稀释血清法,一为稀释病毒法。目前常用微量法中和试验,其主要是采用固定病毒-稀释抗体法。

    (2)捕捉方法ELISA查乙脑IgM抗体

 乙型脑炎病毒感染后机体的最早的免疫应答反应是产生IgM机体,由于乙脑的潜伏期为4d-21d,平均为10d-14d。故一旦出现神经系统的症状,从血中或脑髓液中就可能查到特异的IgM抗体。一般IgM抗体持续存在一个月左右,查到IgM抗体,尤其是在脑脊液中查到IgM抗体,结合症状就可以诊断乙型脑炎。捕捉法ELISA实验,即利用包被在聚苯乙烯塑料上的抗人IgM抗体,捕捉感染者标本中IgM抗体,又利用乙脑抗原与IgM抗体的特异性结合,在用酶标抗乙脑抗体检测已结合于IgM抗体的乙脑抗原,方法特异敏感出结果快速,适用于早期快速诊断。

 上海传染病院生产的ELISA 检测IgM抗体用这方法。

    (3)间接法ELISA查乙脑IgG抗体

    利用包被在塑料孔中的乙型脑炎抗原去吸附人的抗乙型脑炎抗体,再用免抗人IgG的酶标记物和酶的显色剂去检出有无人IgG被抗原吸附,从而测得抗乙脑IgG抗体的存在。所用的包被抗原成份不同,所检测的都是与之相对应的抗体,一般用乙脑的全病毒抗原作检测,故它测出的不但有中和抗体,而且还有乙脑的非中和抗体。

    我们正在研制间接法ELISA查乙脑IgM和IgG抗体试剂。

3、聚合酶链反应PCR技术

    设计乙型脑炎特异引物,进行PCR扩增反应,将产物纯?蟛舛ê塑账嵝蛄?能直接揭示有无乙脑病原体的存在。

该方法敏感性高,PCR核酸诊断能直接揭示病原体的存在,能客观反映病原体在人体内感染及活动情况,通过检测病原体的动态变化过程,可以作为临床治疗中的一个有效监控手段;另外采用核酸诊断技术还可以检测到常规检测方法难以检测到的病原体;PCR检测还可以克服酶免检测技术中从感染到抗体产生的窗口期问题。

注意气溶胶污染导致假阳性!需要规范的实验室条件及操作规范。

4.实时荧光PCR技术

在同一个密闭反应管将荧光标记探针或荧光染料加入到PCR扩增反应体系中,使用一种特殊的装配有荷电偶联装置(Charge coupled device CCD)的PCR仪,CCD能够按照一定的时间周期检测收集荧光信号,由此将扩增与检测结合在一起,通过检测荧光信号的动态变化适时监测PCR的每个循环的扩增情况称之为实时荧光PCR。“实时”是指在每一个PCR循环后检测扩增产物,当PCR扩增反应结束后,我们可以得到每个样品的PCR扩增产物变化曲线。

投稿人:周惠琼

单位:广东省疾病预防控制中心

                                                                               (2006-9-5)

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