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细菌性脑膜炎主要病原体的实验室检测技术
发布日期: 2006-11-30 浏览次数: 撰稿人: 部所: 字体:
细菌性脑膜炎主要病原体的实验室检测技术 脑膜炎可以是细菌性或非细菌性的(病毒性)。很多细菌都能引起脑膜炎,但最常见的菌种是脑膜炎双球菌、肺炎双球菌和流感嗜血杆菌等。大多数病例发生在儿童或青少年。细菌可以通过以下途径到达脑膜。血源传播;由邻近感染病灶的扩展(如鼻窦炎);或脑脊液与外界的沟通(例如,穿通性外伤或神经外科手术等)。 表 不同年龄脑膜炎的致病菌 病原菌发病人群 脑膜炎双球菌青少年和青年多发于冬春季 肺炎双球菌成人 流感嗜血杆菌(型)婴儿(产后1个月以上)成人少见(除非有头部外伤等) 单核细胞增多性李斯特菌免疫抑制病人和老年人 葡萄球菌新生儿(常见于产后2周)可见于头部外伤、菌血症及神经外科手术 大肠杆菌与克雷白杆菌-肠杆菌免疫抑制病人、外伤、菌血症、 院内感染 下面我们对引起脑膜炎的主要病原体脑膜炎双球菌、肺炎双球菌和流感嗜血杆菌的常规实验室检测技术做较详细的介绍。主要参考国际疫苗研究所在广西进行的一项针对5岁以下儿童脑膜炎双球菌、肺炎双球菌和流感嗜血杆菌发病情况的流行病学调查的实验室培训资料,相信对我们日常有关疾病的防治工作有指导意义。 标本收集及运输 临床标本的收集在分离和鉴定致病细菌过程中非常重要。标本应该在抗菌素治疗之前收集。流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、脑膜炎双球菌都是营养要求高而且对环境抵抗力弱的细菌,因而临床取材后应立即接种到肉汤中(如血液)或固体平板上(鼻咽拭子或其它液体)。所有标本应尽快在微生物学实验室处理,如不能立即做细菌培养,应用合适的运送培养基,并尽快将标本送到实验室。 一、 脑脊液(CSF) 如果怀疑为脑膜炎,CSF是用于分离和鉴定病原体最好的标本。CSF应直接接种到巧克力平板和血平板上培养,或取1ml接种到培养瓶或肉汤中,剩余的CSF要放于小瓶中(做革兰氏染色或抗原、PCR试验等)。CSF一经采集就应尽快(最好在1-2小时内)送到微生物实验室,不要暴露于阳光下,防止过热或过冷。在运输过程中,CSF培养物应保温在22-37℃之间。如标本不能及时转种,应将盛有CSF的瓶子尽快放到实验室37℃培养箱里,切勿冷冻。CSF在进行细菌培养前,一般不进行离心沉淀。这其中有许多缘由,包括离心速度不适,不能沉淀细菌、无菌问题,以及CSF的量不多。 二、 血液 对脑膜炎或疑似菌血症的病人都要抽血。如果没用抗菌素,80%细菌性脑膜炎病人的血培养为阳性。如果抽脑脊液前,病人已经用抗菌素,此时作血培养很重要,因为血培养瓶中的树脂可灭活血中的抗菌素,提高细菌性脑膜炎的诊断率。一些因素可影响血液培养物的敏感性:如采血的次数,每次采血量及中和血液中的抗菌物质而采用的各项步骤。除非是严重败血症和重症脑膜炎,一般必须采取大量的血液(4-10ml)才能检测出血液中低浓度的细菌。商品化的血培养瓶明确说明需要血量的最小和最大体积(常标示于瓶上)。因为在采血的过程中没有用抗凝剂,所以血液必须加到液体培养基中才能运输,并且血液要在采完后一分钟内加到培养基中。在运输过程中,应使其处在一个恒温环境中(即温度不能低于18℃,高于37℃)。最好把标本放35-37℃培养箱中保存或室温保存。切记血培养标本不可置于冰箱中,因这样会严重影响微生物的生长。所有的这些已接种了的血液培养基应当在12-18小时内送到实验室进行传代培养。 三、 鼻咽标本采集 最好应将鼻咽标本在富含营养的选择性培养基(如Hib抗血清平板)上培养,标本采集后,立即涂抹在琼脂平板1/3处。如果标本不能立即培养于生长培基时,应把咽拭子放到能保持细菌活性的培基中。 用无菌棉签伸到扁桃体与悬雍垂后方之间(不要碰颊部、舌与唇),从一侧扁桃体到另一侧扁桃体旋转棉签擦拭咽后部。立即接种或把咽拭子放回转运系统中,回实验室再接种平板。 四、 其他 其他部位感染的标本(如采集出血点)也应在无菌操作下采取。 五、 注意事项 在采集标本过程中,工作人员和患者可能会交互感染。病毒是最危险的,特别是肝炎AIDS病毒。为了降低感染因子传播的危险性,建议: 1.应带上不渗液的乳胶或乙烯手套; 2.不同病人间要更换手套或用消毒剂彻底清洗,消毒剂包括:70%酒精或0.5%的次氯酸钠溶液; 3.血标本应立即接种到培养基中,以防在注射器中凝固。血培养瓶表面用酒精消毒,注射器要放在可高压的容器中。血培养基放到一个密封的容器中送回实验室。 4.每个标本都应有明显标记。 5.若实验室已经关门,最好把标本放35-37培养箱中保存或室温保存。用于培养的标本不可放冰箱中。 初代培养、传代培养及细菌推断性鉴定 细菌学实验室对临床标本的处理需要考虑到许多方面。首先是标本的类型及解剖部位,这将决定标本在接种前是否需要预处理;另一方面是每一个标本应当选用什么的培养基进行初步分离;最后则要考虑孵育的温度和环境。 主要培养基: 1.巧克力平板 2.血平板 3.血液培养瓶 4.加有杆菌肽的流感嗜血杆菌b抗血清平板 5.加有X和V因子的增菌培养基(如酪蛋白酶大豆肉汤TSB) 操作步骤: 如果有可能,标本处理的每一步都应在超净台或专门用于标本处理的隔离(无菌)间进行。 1.初代培养基的接种:对于肺炎双球菌来说,最好的培养基为血平板(BAP)。它是一种含有5%绵羊或马血的胰酶大豆琼脂平板(不能用人血代替)。对于流感嗜血杆菌来说,必须加有血红蛋白和添加剂的巧克力平板(CAP),该菌在BAP上不生长。脑膜炎双球菌和肺炎双球菌在BAP和CAP上都能生长。如果只选一种平板,就用CAP。用接种环划线把细菌分离单个菌落。 脑脊液和其他无菌体液 (1) 当微生物实验室收到脑脊液时,记录其数量及外观(如清澈、混浊、黄色或血性); (2) 取1滴CSF进行革兰氏染色; (3) 分别接种2滴CSF到CAP和BAP上,其余的置于增菌肉汤中或放冰箱保存; (4) 用接种环划线以获得单个菌落; (5) 将平板放35-37℃含5%CO2孵箱内孵育72小时; (6) 分别在24、48和72小时检查培养皿,观察细菌是否生长。如果发现细菌生长,则按下述方法进行细菌鉴定; (7) 每天对CSF增菌培养基和培养瓶进行检查。如果出现细菌生长,则进行传代培养。不管细菌是否出现生长,在1、3和7天都应进行常规传代培养。 血液 血液采集后立即接种到血培养基中,其余的分离血清放冰箱做抗原抗体等测定。 口咽标本 在培养板的1/3部位滚动咽拭子,用接种环在培养板上划线,分离单个菌落,把培养基放5% CO2孵箱内孵育48小时,观察细菌生长情况。如果必要,传代培养,分离纯菌落。 2. 传代培养: 琼脂平板: 在同一培养板上有大量细菌生长,而且单个纯菌落很少或根本没有时,再进行传代培养。分离出单个菌落进行其它检测。可通过菌落的肉眼形态学特征来判定是否对细菌进一步研究。 (1) 用接种环挑出三个单个的可疑为流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、脑膜炎双球菌的菌落; (2) 用接种环对每一可疑菌的菌落划线接种一个新的平板(流感嗜血杆菌和脑膜炎双球菌用CAP,肺炎双球菌用BAP); (3) 把培养基放5% CO2孵箱内孵育24-72小时,每天检查纯菌的生长情况。 血培养瓶或CSF增菌培养基 过夜孵育后的血培养瓶每天进行检查,共7天,如果出现混浊或红细胞的溶血现象,说明液体培养基中有微生物生长,应马上对此液体培养基进行传代培养。 由于肺炎双球菌以及流感嗜血杆菌在培养中生存期很短,所以不管血培养瓶的外观如何,应在过夜孵育后进行一次传代培养,孵育48小时及7天后再进行一次传代培养。即使没有混浊或溶血,也不一定说明没有细菌生长,要继续培养: (1) 旋转培养瓶,混匀内容物。 (2) 用酒精对血培养瓶胶塞的表面进行消毒。 (3) 在取样前,用一无菌针头给该瓶换气。 (4) 用注射器和另一针头从血培养瓶中抽出少量液体(0.25ml)。 (5) 在BAP和CAP上分别接种2滴该液体,划线分离单个菌落。 (6) 把培养板放35-37℃含5% CO2孵箱内孵育48小时,观察细菌生长情况。 (7) 当通过血培养瓶的传代培养证实有细菌生长时,不要再进行培养了。该培养瓶应按安全操作规程处理掉。 (8) 如果培养7天后仍为阴性,应按安全操作规程处理后丢弃。 菌落的肉眼检查 流感嗜血杆菌和脑膜炎双球菌在CAP上生长时,两者相像。但流感嗜血杆菌能发出一种象老鼠样的吲哚气味,而脑膜炎双球菌则没有;脑膜炎双球菌能在BAP上生长,流感嗜血杆菌则不能。 在CAP上有荚膜的流感嗜血杆菌菌落较小,外表光滑、无色、半透明、粘液样融合菌落,而无荚膜的变种则干燥、突起、半透明、非融合的菌落,培养基无溶血和褪色现象。 在流感嗜血杆菌b型抗血清琼脂平板上,杆菌肽抑制大部分正常呼吸道菌群,菌落形态类似在CAP上的菌落,由于在菌落周围有抗原抗体的沉淀,所以菌落周围出现白色晕环。 在血平板上,新鲜的脑膜炎双球菌菌落小而圆、表面光滑、湿润、有光泽、不透明、凸起、边界整齐、有些菌落融合在一起。进一步培养菌落呈灰色;陈旧培养物更加模糊灰白,有时可使菌落下琼脂变黑,分离好的菌落在18小时直径从1mm变为4mm,数天后,边缘呈起伏状。 在BAP和CAP上,肺炎双球菌的周围有一圈绿色的溶血环(a-溶血),有些菌株菌落小而灰色,呈粘液样(露滴样)。新鲜的肺炎双球菌菌落隆起,类似草绿色链球菌。然而。培养24到48小时,这些菌落将变平,中央部分甚至凹陷。可用手持放大镜区分肺炎双球菌和草绿色链球菌。 革兰氏染色 细菌在革兰氏染色后根据其形状、大小、细胞形态及革兰氏反应情况来区分,因此革兰氏染色是快速推断性诊断传染性病原体的重要方法。根据细胞壁的构成和结构不同,细菌或革兰氏阳性,或革兰氏阴性。革兰氏阳性菌细胞壁有一层厚的肽聚糖层和大量的磷壁酸,可抵抗酒精脱色,因此使其仍保持最初的紫色;革兰氏阴性菌在其脂多糖-磷脂的外膜上有一薄层肽聚糖,这层外膜能够在脱色时被酒精破坏,使其中的结晶紫-碘复合物漏出,而被另一种拮抗染料所代替。 取细胞计数后剩余的或离心后的CSF 1大滴放在载玻片上,涂开,不要过厚或过薄,自然凉干,常规染色。 脑膜炎双球菌为咖啡豆状双球菌,可在细胞内或细胞外出现;肺炎双球菌为柳叶状的G+双球菌,有时呈短链状;流感嗜血杆菌小而形态多异,随机排列的G-杆状或球杆状。通过CSF沉淀的革兰氏染色或检测CSF中的特异性抗原,可对流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、脑膜炎双球菌引起的细菌性脑膜炎进行推断性诊断。 可用乳胶凝集反应来检测细菌抗原 在细菌感染,特别是脑膜炎的诊断中,可用快速乳胶凝集试验直接检测细菌抗原,帮助诊断。细菌特异性的多糖抗原扩散到体液中,可使特异性抗体包被的乳胶颗粒发生凝集反应。此试验可以直接定性检测b型流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、大肠杆菌K1型和脑膜炎双球菌A、B、C群等菌的抗原。 可用几种商品试剂盒。如法国梅里埃公司的脑膜炎乳胶凝集试剂盒(Bio Merieux 公司的Slides meningite-kit 5, 货号58803)。 A.试剂和所需物品 1. Bio Merieux 公司的Slides meningite-kit 5试剂盒。 2. 精确的移液管(30μl) B.设备 1. 水浴锅 2. 离心机(CSF的离心管为5~10ml , 转速为 3000rpm ) C.步骤 1. CSF在沸腾的水浴中(100℃)加热5分钟。 2. 以2000rpm离心10分钟,取上清液进行试验。 3. 轻轻摇晃乳胶悬液,使其均匀。 4. 在试剂盒所提供的一次性反应孔里,各加乳胶悬液(R1-R5)一滴。 5. 在每滴乳胶旁加入30µl CSF上清液。 6. 用搅棒混合标本和乳胶试剂,覆盖乳胶在整个表面。每搅拌一次更换搅拌棒。 7. 摇动2分钟。 读取试验结果 在亮光下不用放大观察结果 阴性反应:悬液仍然均匀,外观乳白色。 阳性反应:2分钟内可见凝集(或呈块状) 如果一种乳胶试剂出现阳性反应,则说明所测体液中有相应的抗原。如果在2分钟内出现2种甚至更多种乳胶试剂的凝集,则反应是不可解释的。 脑膜炎双球菌的鉴定 新长出的脑膜炎双球菌菌落边缘清楚,体积较小,圆形,表面光滑,湿润,发亮,半透明,凸起。再培养菌落略呈灰色。陈旧培养物会变成更加不透明的灰色,有时可使琼脂底部变黑。分离较好的菌落可在18小时内从直径1 mm生长为4 mm。对可疑为脑膜炎双球菌的菌落,应进一步做氧化酶试验鉴定。最后,可用糖分解反应证实。通常做革兰氏染色以检查菌落的纯度。(脑膜炎双球菌为革兰氏阴性咖啡豆状的双球菌)。 脑膜炎双球菌的鉴定总结 1、 菌落的革兰氏染色:革兰氏阴性球菌 2、 氧化酶反应:阳性 3、 生化反应:葡萄糖——阳性,产酸(颜色变黄) 麦芽糖——阳性,产酸(颜色变黄) 乳 糖——阴性,不产酸(不变色) 蔗 糖——阴性,不产酸(不变色) 4、血清型:与一种脑膜炎抗血清发生凝集反应 所需材料 1、 血平板(BAP) 2、 生化糖管(葡萄糖、麦芽糖、蔗糖及乳糖) 3、 氧化酶试剂 4、 脑膜炎双球菌分型血清 氧化酶试验 氧化酶试验是测定细胞色素氧化酶存在与否的试验。含细胞色素C细菌在呼吸链中可将四甲基苯二胺氢氧化物转化成一种紫色的化合物。 可用市售的氧化酶试剂。也可自配(将1.0g四甲基对苯二胺氢氧化物和0.1g抗坏血酸溶解在100ml蒸馏水中)。 使用时将滤纸在试剂中浸湿,然后用牙签取一部分待检菌落涂布到滤纸片上,不要用镍铬合金接种环,因镍铬合金可产生假阳性反应。 10秒钟内出现紫色,即为阳性反应。如果时间延长,可能不是脑膜炎双球菌。注意:奈瑟菌属中的其它细菌及一些不相关的细菌也可出现阳性反应。 脑膜炎双球菌分解糖的试验 糖分解试验可进一步鉴定脑膜炎双球菌。酚红是一种敏感的指示剂,在PH6.8或以下的酸性环境中变为黄色。奈瑟氏菌属中的细菌只分解糖产酸,但不发酵糖。脑膜炎双球菌分解葡萄糖和麦芽糖,但不分解蔗糖和乳糖。 方法:用接种针从培养过夜的血平板或巧克力平板上挑取一部分纯菌落,反复刺入培养基内几次,深度达10mm。每一种糖接种之间要将灭菌环灭菌。盖紧试管盖,放37 ℃培养箱内培养。作为阴性丢掉前至少要培养72h。(半固体生化糖管) 结果解释: 如果在培养基的上部份出现混浊而且颜色变为黄色,说明有细菌生长并产酸,此为阳性反应,结果为细菌能分解此种糖。有些在接种24小时就可出现阳性反应,但有些细菌反应较慢,接种后72小时之内还没出现反应,尚不能作为阴性结果。 脑膜炎双球菌也可用梅里埃API-NH生化鉴定条(奈瑟氏球菌和嗜血菌鉴定系统)进行快速诊断,2小时可出结果,货号10400)。也有液体的生化鉴定培养基(如环凯、陆桥等公司的产品)。 表 奈瑟氏菌属的几种细菌对糖的分解反应 细菌产酸 葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖 脑膜炎双球菌++-- 淋病双球菌+--- N.lactamica++-+ M.catarrhalis---- 脑膜炎双球菌的血清分型鉴定 根据荚膜多糖的抗原性不同目前分为12种血清型,即A、B、C、D、H、I、K、L、W135、X、Y、Z和29(D型不再见到)。最常见的是A、B、C、W135和Y。A型是非洲和亚洲脑膜炎流行最常见的菌株,其次是C群。应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。 目前国内生产诊断血清已由中国药品生物制品检定所统一品种即脑膜炎球菌诊断血清:国产售品有多价Ⅰ(包含A、B、C群),多价Ⅱ [含1889(Y)、1890(H)、1892(29E)],多价Ⅲ[含319(W135)、1916(X)、1486(I)、1811(K)群]及各群单价血清,共计13种10群。在做凝集反应时均应以标准菌种做阳性对照,对生化、菌落、菌体形态等方面典型而血清凝集力低或不凝集者,应进一步鉴定或上送鉴定。方法: (1) 滴一滴诊断血清或盐水在清洁的玻片上。 (2) (2)用白金耳刮取菌苔少许,在玻片上沾取少量血清,在一旁研磨均匀,再与血清混匀。 (3)检查从病人分离的疑似Nm时,先用A群和C群抗血清检测,如果是阴性反应,再用其它的抗血清,特别是B或W135型抗血清。健康带菌调查则先做B群,不凝再做其它。 (4)摇动玻片1-2次,在亮光暗背景下观察结果。 (5)不与盐水发生凝集,与一种脑膜炎抗血清发生凝集反应,即为某一型的流脑菌。 (6)在盐水中发生凝集反应,不能作为抗血清分型(无荚膜多糖的细菌)。 肺炎双球菌的鉴定 肺炎双球菌在BAP和CAP上在粘液状菌落的周围出现草绿色的溶血环。可用Optochin(乙基氢化羟基奎宁)敏感性试验和/或胆汁溶菌试验鉴定。 肺炎双球菌的鉴定总结 1. 生长特点:在BAP上菌落周围产生a-溶血环,24小时后,菌落中央常出现凹陷。 2. Optochin敏感性试验:在Optochin或“P”纸片周围出现14mm或大于14mm的透明环为敏感。 3. 胆汁溶菌试验:菌落在2%脱氧胆酸钠(胆盐)中溶解。 4.血清分型:与肺炎双球菌抗血清产生凝集反应。 所需材料 1. 血平板(BAP) 2. Optochin纸片 3. 1.17%(V/V)氯化钡(Bacl2 2H2O) 4. 1%硫酸 5. 2%脱氧胆酸钠(胆盐) 6. 分型血清或乳胶凝集试剂盒 Optochin(乙基氢化羟基奎宁)敏感性试验 原理:某些细菌,如肺炎双球菌,对Optochin敏感,因而作纸片法药敏试验,有明显的抑菌圈,有些细菌,如甲型链球菌对Optochin不敏感,因此作纸片法药敏试验,无抑菌圈,借此鉴别细菌。 方法:用接种环取可疑的带有a-溶血环的菌落,在BAP上划一宽的交叉带。在无菌状态下,将直径6mm的Optochin(“P”)纸片(含5µg ethylhydrocuprein)放到一条线的靠近取菌环开始划线的一端。一个平板上可检测3-4个菌落。5%CO2孵箱37℃培养18-24小时,观察结果。 结果解释:纸片周围有明显抑菌圈,且直径为14mm者可定为肺炎双球菌。无抑制环的a-溶血菌株为草绿色链球菌。抑制环的直径在9-13mm的a-溶血菌株应做胆汁溶菌试验加以确定。(注:不同厂家的试剂有不同的判定结果,请以试剂说明书为准。) 胆汁溶菌试验: 原理:某些细菌具有自体溶解酶,如肺炎双球菌,胆汁或胆盐能促使自体溶解酶产生自溶现象,借此鉴别不同的细菌。 方法: ⑴ 从血平板上取一环可疑菌落,在0.5 ml无菌盐水中制备成0.5 McFarland*标准浓度的菌液。(如果在Optochin试验的平板上长出足够的菌落,可由一条带上取细菌制成悬液。如果不够则从新的血平板上培养细菌) ⑵ 将菌液分成两等份(0.25 ml一管)。一管加0.25 ml盐水,另一管加 0.25 ml 2%脱氧胆酸钠溶液 (胆盐)。 ⑶ 轻轻振荡两管,35-37℃孵育2小时。 ⑷ 定期检查两管,观察含有胆盐的一管细菌是否被溶解。 结果解释:若加胆盐(或牛胆汁)管的培养物变透明、清晰(细菌已被溶解),对照管仍混浊者(细菌未被溶解)为阳性。 用Optochin敏感性试验和胆汁溶菌试验鉴定肺炎双球菌是最准确和最方便的试验。如果在Optochin敏感性试验出现14 mm或更大的抑菌环,此菌为肺炎双球菌。如果Optochin的抑菌环较小,但很明确,可被胆汁溶解,此菌也是肺炎双球菌。然而,如果Optochin的抑菌环小,而且也不能被胆汁溶解,那么该菌不是肺炎双球菌。 表 用Optochin敏感性试验和胆汁溶菌试验鉴定肺炎双球菌 Optochin敏感性试验(mm)胆汁溶菌试验结果解释 抑菌环>14+肺炎双球菌 14>抑菌环>8+肺炎双球菌 14>抑菌环>8-不是肺炎双球菌 抑菌环=0-不是肺炎双球菌 注:*临床上95%的肺炎双球菌用此方法分离 0.5 McFarland*标准浓度溶液按以下方法配制:把0.5ml 1.174%(V/V)氯化钡溶液加入99.5 ml 1%硫酸中,混匀即成。室温下避光保存,每6个月制备一新鲜的标准液。 分型鉴定试验 肺炎双球菌可用肺炎球菌实验体系(血清学学会公布)的荚膜反应实验分型。鉴定肺炎双球菌时,使用十二种抗血清可将从血液或脑脊液分离出的90-95%肺炎球菌进行分群或分型。每群抗血清包括2-7种血清型。首先,将所研究的菌株逐个地与A-F及H抗血清反应,直到出现阳性反应为止。(最有可能首先出现阳性反应的次序为B、A、H、C、D、E和F)。然后,继续对抗血清P-T进行连续实验,直到完成血清分型或分群。 在确定肺炎球菌的血清型后,个别因子血清可用于更精确的鉴别 荚膜肿胀试验 1、在0.5 ml无菌盐水中乳化几个新长出的肺炎球菌菌落,混匀后的溶液轻微混浊。目的是使每个油镜视野含有50-100个细菌。 2、按照前面叙述的原则,把5μl细菌悬液和5μl抗血清在载玻片上混合。 3、空气干燥载玻片。 4、每个样品加5μl美蓝并盖上盖玻片。 5、高倍镜下观察后再换成油镜观察。 结果解释 如为肺炎球菌,荚膜显著肿大,菌体周围有一无色而宽的环状物(即荚膜与抗体形成的复合物)。菌体本身无变化,染成蓝色。这是因为免疫沉淀导致荚膜的折射率发生改变所致。此外,也可观察到细菌的凝集反应。 表 用14种不同的抗血清中的一种或两种进行的肺炎球菌分型或分群实验 血清PQRST非疫苗血清型 A118452 B19638 C7 2024:31:40 D 9 1116:36:37 E 12103321:39 F 172227:32:41 H1423 15 13:28 G 29:34:35:42:47 I 25:38:43:44:45:46:48 注:抗血清G和H不包括在肺炎球菌实验中。通常临床分离的肺炎球菌菌株不到2%属于这两抗血清包括的血清型。 另有单独鉴定肺炎链球菌的乳胶凝集试剂盒(梅里埃 58821):乳胶颗粒是用所有血清型抗体致敏的,可以鉴定荚膜抗原。该试剂盒可快速鉴定培养分离出的肺炎链球菌。也有快速生化鉴定卡(API 20 Strep ,货号20600)。 流感嗜血杆菌的鉴定 流感嗜血杆菌是一种小的革兰氏阴性杆菌或球杆菌,培养时培养基中要含有haemin(X因子)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD,V因子)才能生长。此菌在巧克力平板上生长,是因为在制备巧克力培养基,加热血时V因子释放出来。血色素(haemin)可从溶血或非溶血的红细胞中获得。流感嗜血杆菌可根据是否需要X-和V-因子生长来鉴定。 表 根据生长需要鉴定流感嗜血杆菌 种属是否需要X-和V-因子在兔血琼脂上是否出现β溶血 X V 流感嗜血杆菌 + +- 副流感嗜血杆菌 - +- 溶血嗜血杆菌 + -+ 副溶血嗜血杆菌 - ++ H.aphrophilus - -- H.paraphrophilus* - +- 注意:埃及嗜血杆菌与流感嗜血杆菌Ⅲ型有类似的生化反应,但前者不发酵木糖,埃及嗜血杆菌可引起类似脑膜炎双球菌菌血症的临床综合征,在巴西和澳洲引起脑膜炎伴有化脓性角膜炎。 鉴定流感嗜血杆菌b型的总结 1. 菌落的革兰氏染色:多型型的革兰氏阴性杆菌和球杆菌 2. 氧化酶反应:阳性 3. X、V、XV因子的需要情况:(1)X或V因子纸片周围不生长。(2)XV因子纸片周围有菌生长说明需要X和V因子。 4. 血清型:细菌悬液只与流感嗜血杆菌b型抗血清(不与a、c、d、e、f抗血清)在1分钟内发生很强的凝集发应 所需主要材料 1、 巧克力平板(CAP) 2、 胰酶大豆肉汤 3、 胰酶大豆琼脂平板(TSA) 4、 X、V和XV因子纸片 5、 流感嗜血杆菌抗血清 检测是否需要X和V因子 方法: 1. 在CAP上培养细菌以获得纯培养 2. 接种的CAP放35-37℃含5% CO2孵箱培养过夜 3. 将传代培养的细菌在0.5ml胰酶大豆肉汤中制成浓菌悬液(要确保肉汤中没有CAP琼脂培基,在菌液中即使有很少量的琼脂也会干扰细菌的鉴定结果)。 4. 用无菌棉签将细菌悬液划线接种到胰酶大豆平板上。 5. 平板干燥后,把X、V和XV因子纸片放到接种过的平板上。X和V因子纸片的间隔为1-2cm,XV因子纸片与X或V因子纸片的间隔为6cm。 6. 将平板放35-37℃含5% CO2孵箱中孵育24-48小时。 结果解释: 流感嗜血杆菌只在XV因子纸片周围生长,在X或V因子纸片周围不生长,但在X和V因子纸片中间可有细菌生长,因纸片之间X和V因子可相互渗透到一起。 对大多数实验室来说,没有必要测定分离到的嗜血杆菌的溶血反应。 血清分型 绝大多数脑膜炎是由流感嗜血杆菌b型(Hib)引起。分离到的可疑Hi应该用b型抗血清、其他型别的抗血清中的一种和盐水进行检测。与b型抗血清发生很强的凝集反应,与盐水和非b型抗血清不发生反应,可定为Hib。如果分离到的细菌与b型抗血清不发生反应,应该用多价抗血清进行检测。如果为阳性,再与其余的单价抗血清(a、c、d、e和f)进行反应,以确定其血清型。如果为阴性,此菌可能为非典型的嗜血杆菌。 方法 1. 取CAP传代培养的纯菌落在无菌的福尔马林盐水(0.5%福尔马林)中制成浓菌液。 2. 取一取菌环(10μl)上述细菌悬液在玻片上。 3. 加等量的抗血清,混合(先用b型抗血清,一种其他型别的抗血清和盐水做试验,因b型是最常见的)。 4. 轻轻振荡玻片1分钟。 结果解释 在1分钟内出现很强的凝集反应,为阳性。反应强烈时,所有的细菌凝集到一起,悬液变为透明。如果与一种以上的抗血清发生凝集,结果为非典型的细菌。 生化鉴定 流感嗜血杆菌也可用梅里埃API-NH生化鉴定条(奈瑟氏球菌和嗜血菌鉴定系统)进行快速诊断,2小时可出结果,货号10400)。 临床标本和分离到的细菌的保存和运输 流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、脑膜炎双球菌都是抵抗力很低的细菌,因此,在保存和运输过程中必须加以注意。 1、短期保存:如果将流感嗜血杆菌和肺炎双球菌接种到巧克力琼脂斜面(带螺盖的试管),35-37℃孵育过夜,然后4℃保存,保存1周左右细菌的活性很好。这两种细菌在肉汤中不能很好的生长,在最初的琼脂平板上只能存活3-4天。脑膜炎双球菌用卵黄盐水常温保存,但不能冷冻。 2、长期保存:长期保存的最好方法是低温或冷冻干燥。所有的细菌都可在-70℃冰箱中冷冻保存。 将流感嗜血杆菌接种在CAP,肺炎双球菌和脑膜炎双球菌接种在BAP,35-37℃含5% CO2孵箱中孵育18-20小时。观察培养基上的细菌生长情况。 (1)将需保存的菌种刮取两接种环,接种于1 ml脱脂牛奶的2ml螺盖冷冻瓶中(外部螺口)。(2)将菌苔在管壁研磨振荡,使细菌分散在培养基中。每个细菌做双份管。 (3)-70 ℃低温冰箱分类保存。 3、培养物的运送 :培养物经适当的包装后,不用冷冻运送。冷冻保存的培养物必须经过传代培养才能运送。 1)将冷冻保存的细菌培养物,室温下或4℃融化。 2)流感嗜血杆菌接种在CAP,肺炎双球菌和脑膜炎双球菌接种在BAP,35-37℃含5% CO2孵箱中孵育18-20小时。观察平板上细菌的纯度。 3)将一个纯的菌落接种到带螺盖的巧克力琼脂斜面上。 4)35-37℃培养过夜。 5) 包装运送。 附录:质量控制(QC) 为了确保每个微生物实验室能够在一定人群中检测到所调查的细菌,我们必须对每个微生物实验室的设备、培养基、生化试验及技术人员的技术进行系列的评估,使其达到指定的标准。另外,确保不同研究地点检测结果没有差异也十分重要,因为这样可以准确地比较所研究人群间某种感染的发病率。 商品培养基 一般来说,美国的商品培养基,每批都用标准的ATCC菌株进行了严格的质控检查。被评价的培养基包括BAP,血液培养基和CSF肉汤,除少数一些商品培养基外,其余所有的不合格率均小于1.0%。在那些不合格率较高的商品培养基中,CAP就是其中一种。为此,美国NCCLS已经改写了题为“商品微生物培养基质量保证”的M22-A2文件,其中包括所有的实验室都可根据自己质控标准对所有的商品化CAP培养基进行质控。 巧克力培养基质控步骤 1. 随机从所提供的每一批培养基中抽取10个平板,检查一下培养基的灭菌情况,放35-37℃含5% CO2孵箱中孵育48小时,然后再在室温下孵育48小时,观察是否有细菌生长。即使这些平板没有细菌生长,也应弃之不用。 2. 取10块平板分成两份,分别划线接种一滴(30μl)用生理盐水1:1300的0.5McFarland 标准(1-2×104cfu/平板)的淋球菌ATCC No.43069和流感嗜血杆菌ATCC No.10211,检查该培养基上细菌的生长情况。划线接种后,将这些培养板放35-37℃含5% CO2孵箱中孵育24和48小时后,分别检查是否有细菌生长并记录下菌落的大小及估算出菌落的大概数量。 其它商品培养基(包括试管培养基) 1. 保存一份质控操作步骤说明书,并确保其产品符合NCCLS M22-A标准。 2. 每批新运来的培养基检查5%,出现下面任何一种情况均可说明由于运输原因可能影响细菌的生长。 (1) 培养皿破碎;(2)倒板不均匀;(3)平板中的培养基有裂缝;(4)溶血;(5)结冰;(6)气泡或凹陷过多;(7)污染。 收到培养基时,如果发现任何不正常情况,都应填写书面QC违章事件表格并通知微生物实验室负责人。如果培养基出现细菌污染、结冰或溶血,应把这些培养基扔掉,其余的培养基也不能使用,除非培养基数量不够时可使用,但必须按照商品CAP的要求进行QC,质控合格后方可使用。否则,应要求立刻进行替换。如果培养基的整体性保持完好,只是有裂缝或气泡/凹陷过多或倒板不匀,则应全面进行检查,查出后弃去不用。生产厂家应当在QC违章事件表格上注明如何正确操作以及使用的时间。以后运来的培养基如果有影响了细菌的生长QC问题,则应按照QC操作步骤进行处理,直到当地的微生物学家确认生产者的错误已被纠正。 储存和制备工作对照培养物 1.将ATCC的冷冻干燥培养物按每个包装内部的说明复活,划线接种到两个BAP上,使其充分生长。接种后,在适宜的环境下35-37℃孵育18-24小时。 2.检查生长菌的纯度,并按上述方法进行鉴定。 3.从BAP上取下生长细菌,悬浮到50ml无菌的脱脂奶中(冷冻保存介质),将菌液的浓度调到0.5 McFarland 标准浊度(即1-2×108cfu/ml),然后分装到低温保存管中,每管1-2ml,-70℃冷冻保存。制备一次至少要保证够一年使用,而且要不定期的制备此种-70℃保存的培养物。 4.从储存培养物上刮取一些冷冻的脱脂奶细菌悬液,划线接种到BAP上,在适宜的环境下35-37℃ 孵育过夜,连续三次传代培养,制成工作用菌株。 5.此法制备的工作用菌株可以在4℃冰箱内保存4周左右。储存培养物每一代都可取1-2ml放冷冻管中低温保存,以后再按上述过程制备工作菌株。 6.每个储存管或工作菌株都应标上细菌的名称、ATCC的数码、冷冻日期、所传代数(如G0、G1、G2、G3)以及小瓶的号码。由于冰箱机械或电源方面的故障而造成这些冷冻小瓶解冻均可影响传代细菌的生长。我们可以通过传代培养时计算菌落的数量,并与冷藏前原始培养物的菌落数比较来判断在保存过程中是否有过融化。 试剂的质量控制 鉴定细菌所用的每种试剂必须进行检查,保证其性能良好。对商品化的每一批试剂或实验室每一次自制试剂通常要用阳性反应菌和阴性反应菌进行测试,在应用过程中以天、周或月为单位重复测试。下表为本研究所用的试剂以及用来检测试剂的ATCC菌株,预期的反应结果和应进行的QC频率。 QC频率表 试剂ATCC对照菌株预期结果QC频率 氧化酶Pseudo.aeruginosa(27853)+(紫色)每批 E.coli (25922)-(无色)每天 革兰氏染色E.coli (25922)G-杆菌(红)每批 Staph.aurens(25923)G+杆菌(蓝)每天 Optician Discs肺炎双球菌(6305)易感14mm或>纸片每批、每周 X.V.XV因子片流感嗜血杆菌(10211)在XV片周围生长每批 在X和V片间生长每周 胆汁溶菌试验肺炎双球菌(6305)易感(清亮透明)每批 Enterocdcusfaecahis(29212)不易感(混浊)每月 糖发酵管Neisseria lactamica(23971)对照(无CHO)Glu+male+每批 Lact+sucr-每周 淋球菌(43069)对照(无CHO)Glu+ male- Lact- sucr- 血清分型流感嗜血杆菌(10211)+凝集反应每批每月 副流感嗜血杆菌(7901)-无凝集反应 脑膜炎双球菌(13090)+凝集反应每批每月 淋球菌(43069)-无凝集反应 肺炎双球菌(6305)+凝集反应每批每月 Enterovoccus faecaus(29212)-无凝集反应 仪器、设备的质控 本研究所用的仪器必须保持维修,定期进行预防性的小修、清洗以及检查。必须保证研究期间关键的设备不出现故障。另外,更重要的是本研究所用的设备要校准,以保证细菌生长良好、鉴定可靠,标本和细菌的分离物保存完好,能用于以后标准实验室的研究。遇到的所有问题,防护性保养、检查以及修理都必须有文字记载。在研究期间,关键设备如孵箱出现问题必须首先报给微生物学负责人,此人再通知当地微生物学专家。然后由此专家以书面形式把问题反映给IVI的中心标准实验室,并说明准备采取的解决问题的措施。 微生物学仪器质控监测 仪器QC操作步骤QC频率正常值界限 孵箱记录温度每天一次或连续35.5±1℃ 检查容器的水是否装满每天一次湿度为40-50% 消毒并清洗水容器和孵箱外表每周一次 冰箱记录温度每天一次或连续2-8℃ 冰箱(-70℃)记录温度每天一次或连续-60--75℃ 除霜(样品放在盛有干冰的绝缘盒子里)每4-6个月一次维持<1cm厚的冰 烛缸用接种环取10μl 1McFarland淋球菌悬液检测其生长情况每周一次生长良好 离心机清洗转子,管套及载物器每周一次 检查刷子的损耗读每月一次 检查速度表每年一次 定量接种环通过伊文兰染色试验检测体积每月一次或每批一次±20% 显微镜擦掉油渍和污物每天一次 擦洗物镜和聚光镜每月一次 Kohler照明调节每月一次 显微镜的保修每6个月一次 超净台Ⅱ表面的常规消毒和可见气流规格的检测每天一次 按照正常操作再次验证HEPA滤器的效力和气流的方式/速度每年一次 (刘美真供稿)
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