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登革病毒实验室技术
发布日期: 2006-09-21 浏览次数: 撰稿人: 部所: 字体:
 
一、登革病毒病原学检测技术
1.应用单克隆抗体免疫荧光法(McAb-IFA)检测登革病毒抗原
原理:感染登革病毒的蚊虫体内,携带有登革病毒抗原,可用登革病毒单克隆抗体免疫荧光法检出蚊体内的特异性抗原。
材料:多孔载玻片、10~100μl可调移液器、染色钵、试管、pH7.2PBS、1 ~4 型登革病毒单克隆抗体、羊抗鼠IgG荧光抗体、丙酮等。
检测步骤:
①蚊虫标本制备:待蚊虫胃内容物消化后,置-40℃冻死,用解剖刀去翅、肢,将头部和躯体分别放于载玻片圈内,盖上一块与之相对应的玻片,轻轻加压,使蚊组织最大限度地附在玻片上,小心分开两玻片,用镊子去除大片的骨骼,吹干,冷丙酮固定10分钟。
②用PBS轻轻漂洗一次,再用蒸馏水漂洗一次,吹干。
③加登革病毒单克隆抗体,覆盖蚊组织,置于湿盒中,37℃水浴30分钟。
④取出,用PBS洗2次,蒸馏水洗1次,吹干。
⑤加羊抗鼠IgG荧光抗体,如③、④,孵育,漂洗。
⑥封片胶封片,荧光镜检。如单抗已荧光标记则免去⑤,即为直接法。
结果判断:用荧光显微镜观察,检出组织细胞胞质内有特异性黄绿色荧光,判为阳性,阴性无荧光出现。
意义:在蚊虫组织中,检出登革病毒抗原,可确诊被检蚊虫携带有登革病毒,可用于登革热流行病学调查。
2、C6 /36白纹伊蚊细胞分离登革病毒
原理:登革病毒是一种具有严格的细胞内存活的生物,必须生活在活的细胞组织内,C6 /36白纹伊蚊细胞对登革病毒十分敏感,根据观察病毒对其产生的变化(病变等现象)和应用特异、敏感的检测技术,检出病毒的存在和型别。
材料:
①50~200ul、1ml可调移液器,200ul、1ml无菌吸头
②无菌细胞吹打管、吸管
③无菌平底微量96孔/24孔组织培养板或细胞管
④C6 /36细胞
⑤CO2培养箱、生物安全柜、倒置显微镜
⑥生长液(200ml):Eagle's MEM溶液174ml,3%谷氨酰胺2ml,1万单位青链霉素2ml,7.5%碳酸氢钠2ml,新生小牛血清20ml,用前混匀;
⑦维持液的配制(200ml):Eagle's MEM溶液190ml,3%谷氨酰胺2ml,1万单位青链霉素2ml,7.5%碳酸氢钠2ml,新生小牛血清4ml,用前混匀。
⑧标本处理液(100ml):Eagle's MEM溶液90ml, 50µg/ml庆大霉素100µl,1000µg/ml两性霉素B 1ml和1000U/ml青链霉素1ml,小牛血清2 ml,用7.5%碳酸氢钠溶液调至PH7.2,用前混匀。
检材的采集及处理:
①病人:无菌采集发病后5天内静脉血3ml,放冰壶送实验室分离血清,接种组织细胞培养,不能及时接种的,将血清置-20℃保存,接种前血清标本先用标本处理液进行10-1倍稀释,4℃作用2小时处理后再接种C6 /36细胞。
②尸体检材:可取血、脑脊液、脑组织、肝等。
③蚊:采集吸过血的埃及伊蚊,白纹伊蚊或其它可疑蚊种,用0.50mol/L(10%)葡萄糖液喂养,至胃血完全消化后置-20℃,待死后按蚊种及捕获地点分组,以10~20只一组为宜,经生理盐水冲洗数次后,转入研磨器,加1ml标本处理液,研碎均匀,置预冷4ºC的离心机上,10000rpm离心10min,取上清液于4℃作用2小时处理后接种C6 /36细胞。
病毒分离:
C6 /36(白纹伊蚊纯系细胞株)传代细胞在24孔细胞培养板上长成单层后,倒去培养液每孔接种用标本处理液稀释成10-1的患者血清0.1ml或蚊悬液或组织悬液0.2ml,37℃吸??1小时后加维持液0.9ml及0.8ml,置35℃静止培养,观察7天,若细胞出现膨大至融合,折光度增强、颗粒增多等现象,取细胞悬液0.1ml,进行传代,仍出现同样病变者应保种并进行鉴定,若7天后细胞不出现病变,需盲传1~2代,仍不出现病变者用间接免疫荧光试验作进一步检查,阴性者作阴性报告。
3、间接免疫荧光试验(FA/IFA)鉴定登革病毒
试验方法:
①细胞片的制备:把出现“++”病变的C6 /36细胞管倒去维持液,(若不出现病变,则需培养7天再制片)用pH7.2PBS洗2次后加PBS3ml,用滴管把细胞从管壁上吹下,吹散,2000r/min离心5min,弃去PBS,加0.2ml PBS把沉渣吹散,滴加在10孔的载玻片各孔中,冷风吹干,加冷丙酮固定10min,用PBS冲洗2次,蒸馏水漂洗1次,冷风吹干,-20℃保存。正常C6 /36细胞对照按同法制片。
②试验方法:取出保存的待鉴定细胞片或脑组织片,冷风吹干,于各孔中按顺序滴加4个型登革病毒使用单位的单克隆抗体,各型2孔,对照2孔滴加PBS,置湿盒内37℃水浴30min,取出用PBS冲洗3次,蒸馏水漂洗1次,冷风吹干,滴加含130μmol/L(1:8000)伊文思蓝的2单位抗鼠IgG荧光抗体,置湿盒内37℃水浴30min,用PBS冲洗3次,蒸馏水漂洗1次,冷风吹干,用甘油缓冲液封片,镜检,记录结果。
结果判断:
特异性免疫荧光呈黄绿色颗粒,分布在感染细胞的胞浆内,正常组织细胞被染成橙红色或暗红。
意义:从病人血液、组织或蚊媒中分离出登革病毒,经鉴定,可确诊登革病毒感染和病毒型别。
4、应用乳小白鼠分离登革病毒
原理:新生小白鼠对登革病毒十分敏感,根据观察病毒对其产生的致病等现象和应用特异、敏感的检测技术,检出病毒的存在和型别。
材料:参考“C6 /36白纹伊蚊细胞分离登革病毒”,C6/36白纹伊蚊细胞改用1~3日龄乳小白鼠。
检材采集及处理:参考“C6 /36白纹伊蚊细胞分离登革病毒”。
病毒分离:
每一检材接种一窝1~3天龄小白鼠,每只脑内接种全血或1:10血清或蚊悬液、组织悬液10~20μl,接种后48小时内死亡者作非特异性死亡,弃去。存活者观察至10天左右仍未发病时,剖取其中2只,取脑,用pH 8.0肉汤制成10%悬液,盲传1~3天龄小白鼠一窝,其余的及盲传的均观察至第四周,未发病作阴性结果。在观察期内若发病(松毛、蜷缩、活动力降低、站立不稳、抽搐、离群、不进食、瘫痪等症状)则剖取半边脑,按盲传法制成10%鼠脑悬液,转种1~3天龄小白鼠,并作无菌试验,另一半脑置5.43mol/L(50%)甘油缓冲液中低温保存。无菌试验阴性而仍出现以上症状的乳鼠作为可疑毒株传代、保种,并进行鉴定。
病毒鉴定:
① 脑组织片的制备:取发病濒死的小鼠脑组织以冰冻切片制成10孔组织片,经冷风吹干,冷丙酮固定10min,冲洗、吹干后放-20℃保存。正常脑组织同法制作。
② 试验方法、结果和意义:参考“间接免疫荧光试验(FA/IFA)鉴定登革病毒”。
 
二、登革病毒血清学检测技术
1、血凝抑制(HI)试验检测登革病毒血凝抑制抗体
原理:pH和温度被控制在适当的条件时,登革病毒能使鹅、鸡、鸽及绵羊红细胞发生凝集,而在特异性抗体存在的情况下这种凝集现象能被抑制,称之为血凝抑制试验(HI),可用于血凝抑制抗体的测定。登革病毒血凝素抗原可以用经蔗糖和丙酮抽提去酯的感染登革病毒的乳鼠脑抗原,也可以用经浓缩或纯化的感染登革病毒的蚊细胞培养抗原。
材料:
①U型塑料板(96孔)
②10~100μl、100~1000μl可调移液器、10ml吸管。
③1~4型登革病毒鼠脑蔗糖丙酮抗原或登革病毒 C6/36细胞抗原,抗原与同型抗体滴度应大于与异型抗体交叉反应2个滴度以上。
④稀释液:pH6.4磷酸缓冲液,用于稀释鹅血球。
pH9.0硼酸缓冲盐水,用于稀释血凝素和血清。
⑤鹅血球:于鹅翅下静脉抽血,置于血球保存液混匀,用生理盐水洗3次,最后以2000转/分钟离心15分钟,弃去上清,用pH6.4PBS稀释至0.5%鹅血球悬液4℃保存备用。
⑥待检血清处理:用生理盐水把血清稀释成1:10,置56℃水浴灭活30分钟,用10倍量4℃丙酮处理2次,离心去上清,沉淀物真空干燥,加入pH9.0硼酸缓冲盐水恢复到1:10浓度,4℃过夜。然后每管加入50%鹅血球0.05ml,37℃水浴30分钟,离心沉淀取上清,即为1:10处理血清。阴、阳性对照血清同方法处理。
检测步骤:
①血凝素滴定:
在塑料板上,每孔加pH9.0硼酸缓冲盐水25μl,各取1~4型登革病毒抗原25μl各置于第1孔,作倍比稀释,最后一孔混匀后弃25μl。然后于每孔补加pH9.0稀释液25μl,各加0.5%鹅血球50μl混匀,置于37℃水浴作用2小时,结果以最高稀释度出现“++”为1个血凝单位,正式试验用4个单位。
②血凝抑制试验:
在塑料板中,除第1孔外,于各孔加入pH9.0硼酸缓冲盐水25μl,第1、2孔和第8孔分别加入25μl已处理待检血清,从第2孔开始,作倍比稀释,最后一孔不稀释,补加pH9.0硼酸缓冲盐水25μl,然后按顺序于第1排至第4排各分别加入登革病毒1~4型4个单位的血凝抗原25μl,最后一孔不加抗原,混匀,放37℃水浴2小时,再于每孔加0.5%鹅血球50μl,混匀,37℃水浴2小时,观察结果。
结果判断:
以完全抑制鹅血球凝集的血清最高稀释度倒数为血凝抑制抗体效价。
意义:恢复期抗体效价比急性期抗体效价有4倍或4倍以上增高可确诊。初次感染登革病毒的病人恢复期血清标本的抗体效价通常是640或低于此值。相对而言,第二或第三次感染登革病毒的病人抗体效价在发病的头几天上升得很快,通常可达5120~10240或更高,因此,急性期血清标本抗体效价在1280或以上的提示有近期登革病毒感染。
2、用免疫荧光法(FA/IFA)检测双份血清IgG抗体
原理:某些荧光素(常用异硫氰酸荧光素)能与抗体蛋白分子结合,而不丧失抗体活力,仍能和相应的抗原发生特异免疫反应,产生免疫复合物,这种复合物由于有荧光色素的参与,在荧光显微镜下显示荧光,表明有特异性抗原存在。直接免疫荧光法可用于检测感染细胞内的特异性抗原,间接免疫荧光法可查待检血清中的特异性抗体。
材料:
①10~100μl,100~1000μl可调移液器各1支。
②登革病毒1~4型抗原片(登革标准毒株感染BHK、Vero或C6 /36细胞制备,低温干燥保存)及相应单克隆抗体(阳性对照)、阴性血清。
③羊抗人(兔抗人)IgG荧光抗体
④待检患者血清(急性期和恢复期)
⑤常用稀释液:pH7.2~7.4PBS、伊文斯兰、封片胶等
⑥荧光显微镜
检测步骤:
① 取出抗原片,冷风吹干。
② 用pH7.2~7.4PBS稀释待检血清,从1:20开始,对倍稀释至所需稀释度。
③ 用移液器依次从高稀释度向低稀释度逐个加入稀释的待检血清于四个型的登革病毒抗原片孔中,每型各加2孔待检系列稀释血清,血清量以完全覆盖抗原面而不溢出孔外为准,置湿盒内,在37℃水浴孵育30分钟。(每次试验同时作阴、阳性对照)。
④ 用pH7.2~7.4PBS漂洗3次,每次约30秒至1分钟?儆谜袅笏?1次,冷风吹干。
⑤ 用pH7.2~7.4PBS稀释荧光抗体,使其内含2个工作单位和1:8000伊文斯兰的荧光抗体,加入各孔中,使完全覆盖抗原面,置湿盒中,37℃水浴作用30分钟,取出,同上漂洗及吹干。
⑥ 用封片胶(或甘油缓冲液)封片,荧光显微镜观察结果。
结果判断:特异性荧光呈黄绿色颗粒,分布在感染细胞浆中。根据荧光亮度和阳性细胞在细胞总数中所占的比例可将荧光反应大致区分为“+~++++”,无荧光者为“-”。检测抗体滴度时,以特异荧光达“++”最高血清稀释度的倒数表示。
意义:由于用登革病毒全病毒抗原检测特异性抗体,与其它黄病毒属病毒(乙型脑炎病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒、圣路易斯脑炎等)不可避免地存在着一定程度上的交叉反应,阳性结果只能说明受检者可能曾受到登革病毒感染,但血清抗体效价达1:80或以上者有诊断参考意义,若恢复期血清抗体效价比急性期血清抗体效价有4倍或以上增长可确诊最近曾受登革病毒感染。
3、中和试验(NT)
原理:当人体感染登革病毒后,血清中可产生保护性的中和抗体,登革病毒与这种特异性抗体作用后,能被特异性地“中和”,抑制登革病毒的复制与繁殖,使其失去感染能力。中和试验包括动物中和试验、组织培养中和试验和空斑减少中和试验三种,每种中和试验又分为固定病毒稀释血清法和固定血清稀释病毒法二种。
动物中和试验由于需要特殊的感染动物房,一般的实验室很难做到,所以更多的实验室采用的是组织培养中和试验和空斑减少中和试验,其中空斑减少中和试验比组织培养中和试验更敏感、特异,但由于前者对操作技术的要求更高,而且病毒噬斑小,出斑时间长,对细胞覆盖培养基的要求也高,故一般实验室多用的是组织培养中和试验。
材料:
①50~200ul、1ml可调移液器,200ul、1ml无菌吸头;
②无菌细胞吹打管、吸管;
③无菌平底微量96孔组织培养板;
④无菌1.5ml 塑料离心管、冰盒;
⑤登革病毒1~4型标准毒株、C6 /36细胞、阳性和阴性对照血清;
⑥CO2培养箱、生物安全柜、倒置显微镜
⑦生长液(200ml):Eagle's MEM溶液174ml,3%谷氨酰胺2ml,1万单位青链霉素2ml,7.5%碳酸氢钠2ml,新生小牛血清20ml,临用前配制混匀;
⑧维持液的配制(200ml):Eagle's MEM溶液190ml,3%谷氨酰胺2ml,1万单位青链霉素2ml,7.5%碳酸氢钠2ml,新生小牛血清4ml,临用前配制混匀。
检测步骤:
1)中和用病毒量预测定
①病毒悬液制备与保存:将新鲜传代收获的登革病毒1~4型标准毒株的组织培养病毒悬液或脑组织制备的病毒悬液,经离心沉淀后吸出上清液,加入20%无抗体小牛血清后分装于细胞冻存管,迅速放入-70℃以下冰箱保存。
②病毒接种:每型登革病毒各取出1小管冰冻的病毒,在冷水中迅速溶化,用维持液将各型病毒分别做10倍稀释,从10-2到10-7,用无菌1.5ml 塑料离心管在冰盒上进行。每个稀释度病毒加4孔,每孔加50 ul,然后每孔加入C6 /36细胞(浓度为1×106/ml)50 ul,置CO2 培养箱内培养,温度33℃,湿度80%。每天观察细胞病变,共观察7天,记录观察结果。
③ TCID50的计算:根据细胞病变计算TCID50,见例表。
在这个例子中,能引起50%的组织培养板出现细胞病变的病毒稀释度在10-5和10-6之间,计算如下:
距离比例=(高于50%的细胞病变百分数-50)÷(高于50%的细胞病变百分数-低于50%的细胞病变?俜质剑?83-50)÷(83-40)=0.7
距离比例与高于50%细胞病变稀释度的对数(log)相加即为TCID50(10-4.7)。由此得出100 TCID50为10-2.7

病毒稀释度
细胞病变孔数/接种数
细胞病变分布
累计
比数
细胞病变百分比(%)
(+)孔
(-)孔
(+)↗
(-)↘
10-3
4/4
4
0
9
0
9/9
100
10-4
3/4
3
1
5
1
5/6
83
10-5
2/4
2
2
2
3
2/5
40
10-6
0/4
0
4
0
7
0/7
0

 
2)组织培养中和试验(固定病毒稀释血清法)
①将待测血清做系列倍比稀释,1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32……根据估计的血清效价决定稀释倍数,用无菌1.5ml 塑料离心管在冰盒上进行;
②将上述测定好的病毒稀释成100 TCID50/0.2ml,用无菌1.5ml 塑料离心管在冰盒上进行;
③将稀释好的血清与稀释好的病毒悬液各取等量混匀,用无菌1.5ml 塑料离心管在冰盒上进行,置37℃水浴中作用1小时;
④在平底微量96孔组织培养板上,每个稀释度病毒加4孔,每孔加50 ul,然后每孔加入C6 /36细胞(浓度为1×106/ml)50 ul,置CO2 培养箱内培养,温度33℃,湿度80%。每天观察细胞病变,共观察7天,记录观察结果。
⑤50%血清中和终点的计算。根据细胞病变计算50%血清中和终点,即能保护50%组织培养管不产生病变的血清稀释度,计算方法见例表。

血清稀释度
细胞病变孔数/总孔数
细胞病变分布
累计
比数
百分比(%)
(+)孔
(-)孔
(+)↘
(-)↗
1∶4(10-0.6
0/4
0
4
0
16
0/16
0
1∶8(10-0.9
0/4
0
4
0
12
0/12
0
1∶16(10-1.2
0/4
0
4
0
8
0/8
0
1∶32(10-1.5
1/4
1
3
1
4
1/5
20
1∶64(10-1.8
3/4
3
1
4
1
4/5
80
1∶128(10-2.1
4/4
4
0
8
0
8/8
100

上述例子能保护50%的组织培养细胞孔不致细胞病变的血清稀释度在1∶32~1∶64之间,具体计算如下:
距离比例=(50%-低于50%的病变率)÷(高于50%的病变率-低于50%的病变率)=(50-20)÷(80-20)=30÷60=0.5
低于50%病变率血清稀释度的对数+距离比例乘稀释系数的对数=-1.5+0.5×(-0.3)= -1.5+(-0.15)= -1.65
-1.65的反对数=1/45
即1∶45的血清可保护50%细胞不产生病变。
意义:中和试验是登革病毒血清学诊断上最特异、最敏感的方法。中和抗体的增长通常与血凝抑制抗体几乎在同一时间或稍稍晚些,且维持的时间至少50年或更长。由于中和试验更加灵敏,一些既往感染过登革病毒的人在检测不到HI抗体时也可检出中和抗体。如果血清标本采集时间适当,初次感染的登革病毒可用中和试验进行型别鉴定。恢复期血清中可见到相应的单一型别反应。第二或第三次感染,不能用中和试验进行血清型别鉴定。
4、应用IgM捕捉酶联免疫吸附试验(Mac-ELISA)检测登革病毒IgM抗体
原理:根据抗原抗体特异性结合的原理,利用抗?甩塘吹タ寺】固宀痘翊觳庋逯械腎gM,再加入特异性抗原和相应酶标单克隆抗体,加底物显色。显色程度与特异性IgM抗体含量呈正相关。
材料和试剂:
①洗板机、酶标仪、恒温温箱或水浴箱(37℃±2℃)。
②10~100μl可调移液器、10ml吸管。
③稀释血清用的试管、吸水纸。
④蒸馏水或去离子水。
⑤登革病毒IgM抗体捕捉ELISA诊断试剂盒
检测方法:
    ①在一系列试管中,将阴、阳性对照血清,临界值较准血清和待检血清稀释成1:100。
②吸取所需量的纯化登革病毒抗原和等体积辣根过氧化物酶标记单克隆抗体至另一干净的玻璃瓶或试管中,混匀后置室温作用1小时。
③混合好标记单克隆抗体和抗原后,在十分钟内各吸取100μl稀释好的病人标本和对照血清至测试板上相应的微孔中,37℃作用1小时。
④弃血清,用洗涤液重复洗涤6次,吸水纸上扣干,分别加100μl上述作用好的登革病毒抗原和酶标单克隆抗体复合物,37℃作用1小时。
⑤弃登革病毒抗原和酶标单克隆抗体复合物,用洗涤液重复洗涤6次,吸水纸上扣干,每孔加入100μl的TMB(四甲基联苯胺),室温作用10分钟充分显现蓝色后,每孔加入100μl的终止液,混匀。
⑥在30分钟内于450nm波长处读取每孔的吸光度。
结果判断:
①酶标仪读数结果判断:
S为待检血清的吸光度
NC为阴性对照血清的吸光度
PC为阳性对照血清的吸光度
CO为临界较准血清的吸光度平均值。
判断标准为:在NC/CO<1且PC/CO>1的情况下,若S/ CO<0.9,则结果为阴性,若S/ CO>1.1,则结果为阳性, 若S/ CO=0.9~1.1,则标本需重做。
②目测法:未加终止液前,在阳性对照血清为深蓝色、阴性对照血清为无色的情况下,若样品孔的颜色比临界较准血清孔深者为阳性,样品孔的颜色比临界较准血清孔浅者为阴性。
意义:IgM抗体阳性,表示患者新近感染登革病毒,适用于登革病毒早期诊断。
 
5、应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测登革病毒 IgM抗体
原理:根据抗原抗体特异性结合的原理,用纯化的登革病毒基因工程表达抗原包被塑料板,与稀释的待检血清中的特异性抗体结合,其中血清IgM部分又与后加入的酶标记的抗人IgM结合,通过酶与底物的作用产生可见的颜色反应,显色程度与特异性IgM抗体含量呈正相关。
材料和试剂:
①洗板机、酶标仪、恒温温箱或水浴箱(37℃±2℃)。
②10~100μl可调移液器、10ml吸管。
③稀释血清用的试管、吸水纸。
④蒸馏水或去离子水。
⑤登革病毒IgM 抗体酶联免疫诊断试剂盒
检测步骤:
①将检测血清用样品稀释液做 1:50稀释。(先将10µl血清加入到90µl的样品稀释液中混匀,再将1:10的稀释血清用样品稀释液做1:5稀释充分混匀。标本稀释后应在2小时内使用。)
②将浓缩洗涤液加入720ml (96T)蒸馏水中混匀备用。
③取出已包被板,加入已稀释血清100µl /孔,同时设阴、阳性对照及空白对照各二孔(阴、阳性对照孔分别直接加入相应对照血清100µl/孔,空白对照加入洗涤液100µl/孔),振荡均匀后,于37℃水浴箱温育40分钟。
④温育后,甩去板内液体,用洗涤液注满各孔,静置一分钟后甩干,重复洗涤五次,扣干。
⑤加入酶标记物50µl/孔(空白孔不加),振荡均匀后,于37℃水浴箱温育30分钟。
⑥温育后,甩去板内液体,用洗涤液注满各孔,静置一分钟后甩干,重复洗涤五次,扣干。
⑦每孔加入底物A、B液各50µl, 37℃避光显色10分钟,再加入终止液50µl/孔,于450nm测OD值。
结果判断:
临界值(cut-off)=0.2+阴性对照均值(N<0.05 时,按0.05计算)
样品OD值大于临界值为阳性,样品OD值小于临界值为阴性。样品OD值在临界值正负10%范围内为可疑,建议用其他方法复试。
意义: IgM抗体阳性,表示患者新近感染登革病毒,适用于登革病毒早期诊断。
6、应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测登革病毒 IgG抗体
原理:根据抗原抗体特异性结合的原理,用纯化的登革病毒基因工程表达抗原包被塑料板,与稀释的待检血清中的特异性抗体结合,其中血清IgG部分又与后加入的酶标记的抗人IgG结合,通过酶与底物的作用产生可见的颜色反应,显色程度与特异性IgG抗体含量呈正相关。
材料和试剂:
①洗板机、酶标仪、恒温温箱或水浴箱(37℃±2℃)。
②10~100μl可调移液器、10ml吸管。
③稀释血清用的试管、吸水纸。
④蒸馏水或去离子水。
⑤登革病毒IgG 抗体酶联免疫诊断试剂盒
检测步骤:
①将检测血清用样品稀释液做 1:50稀释。(先将10µl血清加入到90µl的样品稀释液中混匀,再将1:10的稀释血清用样品稀释液做1:5稀释充分混匀。标本稀释后应在2小时内使用。)
②将浓缩洗涤液加入720ml (96T)蒸馏水中混匀备用。
③取出已包被板,加入已稀释血清100µl /孔,同时设阴、阳性对照及空白对照各二孔(阴、阳性对照孔分别直接加入相应对照血清100µl/孔,空白对照加入洗涤液100µl/孔),振荡均匀后,于37℃水浴箱温育40分钟。
④温育后,甩去板内液体,用洗涤液注满各孔,静置一分钟后甩干,重复洗涤五次,扣干。
⑤加入酶标记物50µl/孔(空白孔不加),振荡均匀后,于37℃水浴箱温育30分钟。
⑥温育后,甩去板内液体,用洗涤液注满各孔,静置一分钟后甩干,重复洗涤五次,扣干。
⑦每孔加入底物A、B液各50µl, 37℃避光显色10分钟,再加入终止液50µl/孔,于450nm测OD值。
结果?卸希?
临界值(cut-off)=0.150+阴性对照均值(N<0.05 时,按0.05计算)
样品OD值大于临界值为阳性,样品OD值小于临界值为阴性。样品OD值在临界值正负10%范围内为可疑,建议用其他方法复试。
意义:恢复期病人血清比急性期血清IgG抗体滴度高,有4倍以上升高,可确诊感染,单份血清检测一般表明其曾受过登革病毒感染,但抗体滴度大于等于1∶320时,结合临床表现及流行病学史,亦可确定为新近病毒感染。
 
三、登革病毒基因检测技术
1、RT-PCR技术检测登革病毒RNA及型别鉴定
原理:PCR技术(聚合酶链反应)是利用双链DNA分子碱基配对原则,在一定条件下扩增DNA片段的体外扩增方法。它的特异性取决于两个人工合成的寡核苷酸引物的序列,引物与待扩增片段两条链两段DNA序列分别互补,待扩增DNA在变性温度下分解为二条单链模板,在复性温度引物与模板两端的DNA序列分别复性(杂交-碱基配对),在延伸温度和单核苷酸存在的条件下,由TaqDNA聚合酶催化,引导引物的5'端向3'端方向延伸合成新链,是一个重复进行的热变性复性延伸的温控循环过程,随着循环次数的增加,DNA产量呈指数上升,经过20个循环以后,从微量基因材料,特异性地扩增可达数百万倍。登革病毒含RNA基因组,因此PCR前需经过逆转录酶作用,合成第一条cDNA链(RT),再进行扩增(PCR),即RT-PCR。设计一对通用引物可扩增登革病毒组基因。设计不同型登革病毒的引物对,可扩增出不同的基因型病毒的基因产物。根据基因扩增产物的片段大小可判断是否登革病毒或某一型登革病毒。
材料及方法:
①设备  移液器(10μl、20μl、100μl、200μl、1000μl)及配套吸头、离心管(1.5ml、0.2ml)及管架、台式高速离心机、普通冰箱、旋涡混合器、电泳仪及电泳槽、微波炉、PCR仪、紫外分析仪等。
②试剂  随机引物、登革病毒特异性引物、RNA提取试剂、AMV逆转录试剂盒、PCR试剂盒、10XTBE缓冲液(108gTris粉,9.3gEDTA-Na2,55g硼酸,完全溶解后用HCl调pH至8.0,加水至1000ml,用前稀释成0.5或1倍)、加样缓冲液(0.5%溴酚蓝和体积比为40%的蔗糖溶于水后,分装于4℃保存)、溴化乙锭(10mg/ml,使用浓度为0.5μg/ml)、琼脂糖等。
引物
序列(5’to3’)
使用浓度
扩增片段大小(bp)
型特异性
D1
TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG
0.5mM
 
通用
D2
TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC
0.5mM
511(D1和D2)
通用
TS1
CGTCTCAGTGATCCGGGGG
0.5mM
482(D1和TS1)
Ⅰ型
TS2
CGCCACAAGGGCCATGAACAG
0.5mM
119(D1和TS2)
Ⅱ型
TS3
TAACATCATCATGAGACAGAGC
0.5mM
290(D1和TS3)
Ⅲ型
TS4
CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA
0.5mM
392(D1和TS4)
Ⅳ型
检测步骤
①病毒RNA的提取:待检标本用RNA提取试剂提取病毒RNA,按照试剂说明进行操作,制备模板RNA;
②逆转录合成cDNA:以随机引物作为逆转录引物,根据AMV逆转录酶反应要求,按试剂说明书操作,以病毒RNA为模板合成cDNA;
③登革病毒4种血清型通用引物的PCR扩增:以D1和D2为引物,以随机引物合成的cDNA为模板,PCR扩增目的基因,反应条件为94℃预变性2分钟,94℃30秒、55℃30秒、68℃30秒,扩增9个循环后,94℃30秒、55℃30秒、68℃30秒(每个循环增加10秒),扩增25个循环,68℃延伸10分钟。
④登革病毒型特异性引物的多重PCR扩增:以TS1、TS2、TS3、TS4和D1为引物,以通用引物PCR扩增产物为模板,多重PCR扩增目的基因,反应条件为94℃预变性2分钟,94℃15秒、55℃15秒、68℃30秒,扩增10个循环后,94℃15秒、55℃15秒、68℃30秒(每个循环增加5秒),扩增10个循环,68℃延伸10分钟。
结果判断:扩增产物用1~2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,如果条带的分子量与预期片段大小相同,表明为相应的登革病毒核酸扩增阳性。
意义:此法可对早期病例登革病毒的检测及分型鉴定,基因扩增产物可进一步进行序列测定和分析。
2、TaqMan探针实时荧光PCR检测登革病毒RNA
原理:登革病毒有四个血清型,根据四型登革病毒共有基因特定的序列,合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针与登革病毒特有的共同基因特异性结合,结合部位位于引物结合区域内。探针的5’端和3’端分别标记不同的荧光素,如5’端标记FAM 荧光素,它发出的荧光能够被检测仪器接收,称为报告荧光基团(用R 表示),3’端一般标记TAMRA 荧光素,它在近距离内能吸收5’端报告荧光基团发出的荧光信号,称为淬灭荧光基团(用Q 表示,淬灭荧光基团也可用一种基本无荧光本底的小沟结合物——MGB,取代了常规可发光的TAMRA 荧光标记,使得新探针技术的荧光本底大大降低,从而提高分辨率)。当PCR反应在退火阶段时,一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合,此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到R所发出的荧光信号;当PCR反应进行到延伸阶段时,Taq酶在引物的引导下,以四种核苷酸为底物,根据碱基配对的原则,沿着模板链合成新链;当链的延伸进行到探针结合部位时,受到探针的阻碍而无法继续,此时的Taq酶发挥它的5’→3’外切核酸酶的功能,将探针水解成单核苷酸,消除阻碍,与此同时标记在探针上的R基团游离出来,R所发出的荧光再不为Q所吸收而被检测仪所接收;在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链,R和Q基团均游离于溶液中,仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。
材料及方法:
设备  移液器(10μl、20μl、100μl、200μl、1000μl)及配套吸头、离心管(1.5ml、0.2ml)及管架、台式高速离心机、普通冰箱、旋涡混合器、实时荧光PCR仪等。
试剂  引物及探针、RNA提取试剂、荧光RT-PCR试剂盒等。
引物/探针
序列(5’to3’)
使用浓度
扩增片段大小(bp)
型特异性
Den-FP
GCATATTGACGCTGGGAGAGA
0.5mM
68
通用
Den-RP
GGCGTTCTGTGCCTGGAAT
0.5mM
Den-probe
FAMCAGAGATCCTGCTGTCTCMGB
0.25mM
D1-FP
GACACCACACCCTTTGGACAA
0.3mM
107
Ⅰ型
D1-RP
CACCTGGCTGTCACCTCCAT
0.3mM
D1-probe
FAMAGAGGGTGTTTAAAGAGAAAGTTGACACGCGTAMRA
0.15mM
D2-FP
CATGGCCCTKGTGGCG
0.3mM
69
Ⅱ型
D2-RP
CCCCATCTYTTCAGTATCCCTG
0.3mM
D2-probe
FAMTCCTTCGTTTCCTAACAATCCTAMRA
0.15mM
D3-FP
GGGAAAACCGTCTATCAATA
0.3mM
124
Ⅲ型
 
D3-RP
CGCCATAACCAATTTCATTGG
0.3mM
D3-probe
FAMCACAGTTGGCGAAGAGATTCTCAAGAGGATAMRA
0.15mM
D4-FP
TGAAGAGATTCTCAACCGGAC
0.3mM
107
Ⅳ型
D4-RP
AATCCCTGCTGTTGGTGGG
0.3mM
D4-probe
FAMTCATCACGTTTTTGCGAGTCCTTTCCATAMRA
0.15mM
检测步骤
病毒RNA的提取:待检标本用RNA提取试剂提取病毒RNA,按照试剂说明进行操作,制备模板RNA;
登革病毒4种血清型通用荧光PCR扩增:用登革病毒通用引物和探针进行荧光PCR扩增。以ABI 7000荧光PCR仪为例,反应条件为42ºC30 分钟,95ºC10 分钟后,进行45个循环的二步法PCR:95ºC15 秒→62ºC40 秒,荧光信号的收集设置在每次循环的退火延伸时进行。
登革病毒4种血清型分型荧光PCR扩增:分别以登革病毒4?盅逍吞匾斓囊锖吞秸虢杏釶CR扩增。以ABI 7000荧光PCR仪为例,反应条件为42ºC30 分钟,95ºC10 分钟后,进行45个循环的二步法PCR:95ºC15 秒→62ºC60 秒,荧光信号的收集设置在每次循环的退火延伸时进行。
结果判断:以荧光PCR反应的前3~15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值,标本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值(Ct 值),以Ct<40、荧光信号数据线性化处理后对应循环数生成的曲线图呈“S”形的标本可判断为相应的登革病毒核酸检测阳性。
意义:是一种灵敏、特异、快速、低污染的登革病毒RNA检测方法,可定性或定量检测登革热病人早期血清中的登革病毒。
 
(郑夔  广东省疾病预防控制中心微生物检验所)
2006-9-20
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